IMOBILISASI ENZIM SECARA PENGIKATAN ION

I.         Tujuan Percobaan

Mempelajari cara imobilisasi enzim protease dan amilase secara pengikatan ion menggunakan bahan pengamobil resin penukar ion.

II.      Alat dan Bahan

2.1  Alat

1.      Neraca analitik

2.      Gelas ukur 100 mL dan 5 mL

3.      Spektronik 20

4.      Kuvet

5.      Erlenmeyer 100 mL

6.      Corong kaca

7.      Batang pengaduk

8.      Tabung reaksi

9.      Rak tabung reaksi

10.  Pipet tetes

11.  Kolom resin penukar ion

12.  Statif dan klem

13.  Botol semprot

2.2  Bahan

1.      Enzim amilase

2.      Larutan iodium 10 %

3.      Protease  biduri

4.      Resin penukar anion

5.      Resin penukar kation

6.      Santan kelapa

7.      Aquadest

8.      Kertas saring

9.      Aluminium foil

10.  Larutan pati 1 %

11.  Kapas

III.   Cara Kerja

a.       Imobilisasi Enzim Amilase

1.      Memasukkan enzim amilase sebanyak 2,5 gram ke dalam erlenmeyer 100 mL, kemudian tambahkan air destilat hingga volumenya 25 mL.

2.      Mencuci 5 gram resin penukar anion beberapa kali lalu masukkan ke dalam erlenmeyer kemudian mengaduk campuran selama 1 jam.

3.      Memasukkan campuran ke dalam kolom kromatografi dan menampung cairan yang keluar dari kolom.

4.      Memasukkan kembali cairan yang keluar dari kolom hingga dua atau tiga kali.

5.      Mengeluarkan enzim amilase amobil dari kolom, kemudian menimbang untuk mengetahui beratnya dan menentukan rendemennya serta menyimpan untuk dilakukan pengujian aktivitas dan retensi aktivitas.

b.      Imobilisasi Enzim Protease dari Getah Biduri

1.      Mengambil 10 g enzim protease getah tanaman biduri, kemudian memasukkan ke dalam erlenmeyer 100 mL dan menambahkan air sebanyak 50 mL, kemudian mengocok hingga semua enzim larut.

2.      Menyiapkan kolom kromatografi yang bersih, kemudian mengisi dengan resin penukar kation dan mencuci dengan air destilat hingga bersih.

3.      Memasukkan larutan enzim sedikit demi sedikit ke dalam kolom yang berisi resin penukar ion dan menampung cairan yang keluar dari kolom (eluat).

4.      Memasukkan kembali cairan yang keluar dari kolom hingga tiga kali, kemudian mengeluarkan enzim protease amobil yang dihasilkan dan menimbang untuk mengetahui beratnya.

5.      Menghitung rendemen enzim protease amobil yang dihasilkan, menyimpan untuk dilakukan pengujian aktivitas dan retensi aktivitas protease amobil yang dihasilkan.

c.       Penentuan Aktivitas Amilase Amobil Hasil Imobilisasi

1.      Memasukkan 5 mL larutan pati 1 % ke dalam tabung reaksi yang berkode A, B dan C, kemudian menambahkan masing-masing tabung 0,1 mL larutan iodium 10 %.

2.      Menambahkan 1 mL enzim amilase ke dalam tabung reaksi A, menambahkan 1 g amilase amobil ke dalam tabung reaksi B dan menambahkan 1 mL air destilat ke dalam tabung reaksi C.

3.      Mengocok ketiga tabung reaksi selama 5 menit, kemudian memasukkan ke dalam air mendidih selama 10 menit.

4.      Menyaringnya, sehingga diperoleh filtrat. Mengukur serapan filtrat yang dihasilkan pada panjang gelombang maksimum larutan pati dalam iodium.

5.      Menentukkan aktivitasnya, yaitu nilai serapan awal tanpa enzim (tabung reaksi C) – nilai serapan setelah penambahan enzim (tabung A dan B)/menit/mL atau g.

d.      Penentuan Aktivitas Protease

1.      Mengambil 5 mL larutan santan kelapa kemudian memasukkan ke dalam tabung reaksi yang berkode A dan B.

2.      Menambahkan 1 g enzim protease hasil ekstraksi dari getah biduri ke dalam tabung A, dan menambahkan 1 g protease amobil ke dalam tabung B.

3.      Mengocok kedua tabung reaksi selama 1 menit, kemudian memasukkan ke dalam penangas air suhu 60^oC dan mengamati waktu yang diperlukan terbentuknya penggumpalan protein pada santan kelapa.

4.      Menentukan aktivitas protease, yaitu waktu yang diperlukan terjadi penggumpalan protein santan kelapa.

IV.   Pengamatan

a.        Imobilisasi enzim amilase

Berat Enzim Amilase (g)	Berat Resin (g)	Berat Enzim Amilase Amobil (g)
2,5	5	8,025

Keterangan:

Berat gelas kimia                              = 47,157 gram

Berat gelas kimia + enzim amobil     = 55,182 gram

§   Penentuan aktivitas enzim amobil

Perlakuan

Hasil

1.    Larutan pati 1 % + larutan iodium 10 % 2.    Larutan pati 1 % + larutan iodium 10 % + enzim amilase 3.    Larutan pati 1 % + larutan iodium 10 % + enzim amilase amobil 4.    Larutan pati 1 % + larutan iodium 10 % + aquadest 5.    Larutan pati 1 % + larutan iodium 10 % + enzim amilase lalu dipanaskan (Tabung A) 6.    Larutan pati 1 % + larutan iodium 10 % + enzim amilase amobil lalu dipanaskan (Tabung B) 7.    Larutan pati 1 % + larutan iodium 10 % + aquadest lalu dipanaskan (Tabung C)

Larutan berwarna biru Larutan berwarna coklat Larutan berwarna bening Larutan berwarna biru Larutan berwarna coklat dan terdapat endapan Larutan berwarna bening Larutan berwarna bening

§  Hasil pengukuran absorbansi

λ	Absorban (A)
	A	B	C
400	-	-	0,047
410	-	-	0,039
420	0,808	0,070	0,069
430	-	-	0,021
440	-	-	0,013
450	-	-	0,026
460	-	-	0,003
470	-	-	0,001
480	-	-	0,008
490	-	-	0,006
500	-	-	0,002

§  Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

§  Perhitungan

1.       Rendemen enzim amilase amobil

 Rendemen enzim amobil   =  x 100 %

                                            = x 100 %

= 107 %

2.       Aktivitas enzim amilase

Aktivitas enzim amilase (tabung A)           =

                                                                    =

                                                                    = - 0,0739 per menit

Aktivitas enzim amobil (tabung B) =

                                                                    =

                                                                    = - 0,0001 per menit

b.      Imobilisasi enzim protease dari getah biduri

Berat Enzim (g)	Berat Resin (g)	Berat Enzim Amobil (g)	Aktivitas Protease (detik)
			Tabung A	Tabung B
10	10	9,907	66	450

§  Perhitungan

Rendemen enzim amobil   =  x 100 %

                                             = x 100 %

    = 49,535 %

V.      Pembahasan

Imobilisasi enzim secara pengikatan ion termasuk salah satu teknik imobilisasi enzim kelompok pengikatan enzim pada pembawa tidak larut air. Imobilisasi enzim secara pengikatan ion didasarkan atas ikatan ion antara molekul protein enzim dengan pembawa tidak larut air yang mengandung ion. Tehnik imobilisasi termasuk tehnik yang sederhana sama halnya dengan imobilisasi secara penyerapan fisik. Bahan pengamobil pada imobilisasi secara penyerapan fisik tidak bermuatan tetapi bahan pengamobil untuk imobilisasi secara pengikatan ion harus bermuatan baik muatan negatif atau positif. Adapun yang termasuk bahan pengamobil imobilisasi pengikatan ion yaitu resin penukar anion atau kation, karboksimetil selulosa, dan sefadeks.

Pada percobaan ini akan dilakukan imobilisasi enzim amilase dan enzim protease secara pengikatan ion. Dengan menggunakan bahan pengamobil resin penukar anion untuk enzim amilase dan resin penukar kation untuk enzim protease.

Proses imobilisasi diawali dengan mencampurkan enzim amilase dengan air bertujuan untuk melarutkan enzim dan mudah terjadi pengikatan iona antara enzim dan karier. Kemudian mencuci resin yang digunakan dengan air, untuk menghilangkan pengotornya. Kemudian memasukkan resin penukar anion yang telah dicuci dan mengaduknya selama satu jam tujuannya adalah untuk pengikatan enzim pada karier (pembawa).

Kemudian memasukkan campuran kedalam kolom kromatografi dan menampung cairan yang keluar. Ketika cairan keluar maka cairan tersebut dimasukkan kembali, dan proses ini diulangi hingga tiga kali. Tujuannya untuk menyeimbangkan kolom penukar ion dengan fasa gerak sebelum digunakan untuk proses pemisahan. Cairan yang keluar dari kolom disebut effluent. Effluent hasil pengaliran dari kolom kemudian digunakan kembali untuk mengelusi hingga effluent bersifat netral. Resin penukar anion adalah resin yang berfungsi untuk mengikat ion negatif. Maka pada proses ini ion negatif pada resin akan bertukar dengan ion negatif pada molekul enzim maka molekul enzim tersebut akan terikat dengan resin sehingga akan terjadi imobilisasi enzim pada resin penukar anion. Pada proses ini hanya sedikit terjadi perubahan konformasi molekul sehingga sifat kespesifikan enzim tidak berubah. Kemudian menimbang enzim amobil dan diperoleh rendemennya yaitu 107 %.

Proses pembuatan enzim amobil dengan menggunakan enzim protease diawali dengan mencampurakan enzim protease dengan air destilata  danmengocoknya tujuannya agar enzim larut dan mudah terjadi ikatan dengan resin penukar kation. Kemudian membersihkan kolom kromatografi dengan air destilata, tujuannya agar tidak ada pengotor pada kolom. Setelah itu memasukkan resin penukar kation kedalam kolom yang sebelumnya telah dibersihkan dengan air, karena dalam resin terdapat banyak pengotor dan menghilangkannya dengan menggunakan air destilat. Penukar kation ini berfungsi untuk menukar kationnya dengan kation pada molekul enzim protease. Kemudian memasukkan enzim sedikit demi sedikit kedalam kolom danmenampung cairan yang keluar (eluat). Kemudian masukkan  eluat kembali kedalam kolom sampai tiga kali pengulangan, tujuannya untuk menetralkan eluat dan mempermudah terjadinya pertukaran kation antar enzim dan resin. Dan pada saat ini juga akan terjadi ikatan antara molekul enzim dan resin penukar kation maka dapat diperoleh enzim amobil. Kemudian menimbang enzim amobil yang dihasilkan. Dan diperoleh rendemennya yaitu 49,535 %.

Kemudian melakukan uji aktivitas enzim amilase amobil yang diperoleh dan pati sebagai substrat. Uji aktivitas enzim amilase amobil dilakukan dengan memasukkan larutan pati 1% dan larutan iodium 10% ke dalam masing-masing 3 tabung reaksi berlabel A, B dan C. Pati merupakan polisakarida yang terdapat pada tanaman (khususnya umbi-umbian) yang terdiri dari amilosa (ikatan α-1,4 glikosida) dan amilopektin (ikatan α-1,6 glikosida). Seluruh tabung menghasilkan warna biru yang menandakan adanya amilosa. Apabila berwarna ungu yang menandakan adanya amilopektin. Tabung A ditambahkan enzim amilase, larutan menghasilkan warna coklat. Tabung B ditambahkan enzim amilase amobil larutan menjadi warna bening. Tabung C ditambahkan air destilata menjadi berwarna biru. Kemudian semua tabung dikocok agar untuk mempercepat laju reaksi. Setelah itu dipanaskan pada air mendidih selama 10 menit untuk menginaktifasi enzim agar dapat diukur aktivitasnya. Setelah dipanaskan dihasilkan warna larutan untuk tabung A yaitu coklat dengan adanya endapan, tabung B dan C yaitu bening. Kemudian menyaring masing-masing larutan kemudian mengukur serapan filtratnya.

Penentuan  aktivitas enzim dapat dilakukan dengan mengukur serapannya menggunakan spektrofotometer. Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang berdasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacum phototube atau tabung foton hampa. Sebelumnya dilakukan pengukuran larutan standar yaitu tabung C dari panjang gelombang 400 nm - 500 nm. Dan diperoleh panjang gelombang maksimum yaitu 420 nm dengan serapan 0,069. Kemudian mengukur serapan tabung A dan B pada panjang gelombang maksimum dan dihasilkan serapan yaitu 0,808 dan 0,070. Setelah dilakukan perhitungan maka aktivitas enzim amilase diketahui yaitu - 0,0739 per menit dan enzim amilase amobil yaitu – 0,0001 per menit. Dari uji aktivitas ini dapat dilihat bahwa enzim amilase amobil mempunyai aktivitas yang lebih baik daripada enzim amilase bebas. Seharusnya yang lebih baik enzim bebas karena enzim amilase amobil adalah enzim yang geraknya terbatas sedangkan enzim amilase geraknya tidak terbatas (bebas). Hal ini dapat terjadi karena kurang teliti dalam melaksanakan prosedur kerja pada praktikum.

Penentuan aktivitas enzim protease yaitu dengan memasukkan larutan santan kelapa kedalam tabung A dan B. Tabung A ditambahkan enzim protease dan tabung B ditambahkan enzim protease amobil. Mengocok kedua tabung untuk mempercepat reaksi terjadi. Kemudian memanaskan kedua tabung pada suhu 60 ^oC. Setelah diamati, pada proses pemanasan terjadi penggumpalan untuk tabung A setelah 66 detik dan pada tabung B setelah 450 detik. Dari hasil yang diperoleh dapat diketahui bahwa aktivitas enzim protease lebih baik daripada aktivitas enzim protease amobil. Hal ini dikarenakan enzim amobil merupakan enzim yang geraknya terbatas sehingga aktivitasnya lebih rendah. Sedangkan enzim protease bebas itu akan lebih cepat karena enzim ini bebas, tidak terjadi ikatan seperti enzim amobil.  

VI.   Kesimpulan dan Saran

Dari hasil pengamatan yang diperoleh dapat disimpulkan sebagai berikut:

1.      Enzim amobil adalah enzim yang geraknya terbatas.

2.      Imobilisasi enzim dengan metode ikatan ion dapat dilaksanakan dengan menggunakan resin, karena molekul enzim mempunyai ion positif atau negatif yang dapat ditukarkan dengan molekul resin yang bermuatan.

3.      imobilisasi enzim amilase amobil dapat dilakukan dengan menggunakan resin anion sedangkan enzim protease amobil dapat dilakukan dengan resin penukar kation.

4.      Imobilisasi enzim ini tidak mengubah konformasi enzim sehingga tidak terjadi perubahan sifat kespesifikan enzim.

5.      Rendemen enzim amilase amobil yaitu 107 % dan rrendemen enzim protease amobil yaitu 49,535 %.

6.      Aktivitas enzim bebas lebih baik daripada enzim amobil karena enzim amobil merupakan enzim yang geraknya terbatas.

Diharapkan agar praktikan memperhatikan proses dalam melaksanakan praktikum agar diperoleh hasil yang baik atau sesuai dengan literatur.